【Experimental Techniques Series-Principles of 10X flex】

Date: 2023-12-1

隨著單細胞定序技術的進步,Single Cell Gene Expression Flex藉由試劑將細胞固定在當下狀態並進行保存,所以 FFPE 切片與組織樣本就也可進行單細胞實驗,讓實驗不再受到樣本型態與樣本製備後立即上機的限制。

標準的scRNA 定序 (single cell RNA sequencing) 使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 polyA tail mRNA 進行建庫定序,要求是較為完整的RNA,最好是使用活細胞,對樣本的運輸與保存環境有一定限制。10X Flex 則針對特定基因序列設計探針 (probe),進行捕獲,可不需要完整的基因 (RNA)。對降解成片段化的基因 (RNA)也能進行檢測。可適用的樣本範圍廣,加上靈敏度高,缺點目前只適用於已知人類及小鼠基因組。 

實驗流程如下:

收集樣本後,隨即以細胞固定液固定樣本,固定後的樣本可在 4 保存一週,或是在-20/ -80℃儲存一到三個月。

樣本上機前會先和高靈敏度的 probe 套組進行捕獲反應,probes 以左、右兩端 (LHS/RHS) 組成。每對 probe RHS 包含探針識別條碼 (probe barcode) Partial Capture Sequence 1 (pCS1)

反應完成後,將樣本、酵素與 10x gel beads 混合並使其包裹在油滴內,pCS1 可以和 10X Gel Beads 上的序列連接並進行延長,從各個細胞生成的產物會共享 10x probe barcode,透過辨認 Barcode 完成建庫。最後進行定序,可對上千個單一細胞進行轉錄分析,進而辨識樣本中的細胞類型或特有細胞。

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