根據遺傳中心法則(central dogma of molecular biology),從基因組生成整個蛋白質組過程中需要有RNA合成調控〈含表觀遺傳調控及轉錄調控〉、RNA降解調控、蛋白質合成調控〈即轉譯調控〉及蛋白質降解調控四個主要調控階段。其中轉譯調控佔所有調控比例的一半以上,是細胞內最重要的調控方式。因此,轉譯組(translatome)的研究可謂是探討遺傳中心法則的核心。
Ribo-seq又稱為Ribosome profiling,由Weissman於2009年發表的轉譯組學研究技術,此方法用來進行核糖體圖譜分析,可得到轉錄組上核糖體的分佈。並且可對細胞內的轉譯進行精確的定量,提供蛋白質合成的相對量、轉譯合成的啟動〈包括非ATG起始〉和終止位置以及uORFs等,並可進一步分析轉譯效率,解析轉譯調控的機制。
Ribo-seq的方法為使用轉譯抑制劑如環己胺(cyclohexamide)來抑制轉譯過程的elongation,誘導核糖體在mRNA上停滯。接著用RNase處理細胞裂解物,把不受核糖體保護的RNA降解掉,然後用梯度離心的方法,分離出被核糖體保護的約30bp左右的mRNA片段稱為「核糖體足跡(ribosome footprints, RFPs)」。這些足跡被用於建構文庫並進行NGS測序,再將這些測序片段mapping到mRNA位置上,可以描繪出核糖體的豐富度和在轉錄組的位置。
至於Ribo-seq的使用限制為需要大量的細胞數樣本,所以對於單細胞不適用。另外,測序中較長的reads能夠更好地幫助mapping到正確的位置,Ribo-seq中所產生的約30bp的短序列進行mapping時難度較高。Ribo-seq可能會有污染的RNA〈包括non-coding RNA或核糖體蛋白複合物〉在核糖體的梯度中移動,因此可能會在Ribo-seq的文庫中存在,因此導致錯誤的結果被讀取。
基於Ribo-seq結果所提供在基因組上的精確位置資訊,可以確定基因組的蛋白編碼能力,因此可以鑑別出非標準的轉譯事件及過去所註解蛋白的不同形式,加上資訊分析的進步也將大幅推進Ribo-seq的應用,進而挑戰傳統的蛋白編碼區域和基因多樣性的觀點。
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