掌握引子設計的要點，能幫助您有效並精準地進行PCR實驗與定序分析，一般PCR與定序引子設計時可注意以下幾點：

1.     定序與PCR引子通常建議介於18-25 mers，GC%介於30-80%

2.     引子必須檢查是否與目標序列只有一個binding site，若有二個(含)以上，定序和PCR時會呈現多種序列。

3.     為確保引子專一性，於3’端至少要有10個nucleotide與目標序列完全互補，且3’端避免2 組以上 G+C(GCGC)，因為可能黏合上序列中GC rich區域。另外，定序引子盡量避免為複合序列。

4.     避免連續的鹼基出現，連續鹼基在引子合成時容易產生合成不完全的現象，尤其連續 4 個以上的 G 出現，還會大幅提高引子的Tm值。

5.     定序使用的引子建議Tm值介於50-58 ℃，若您的PCR引子Tm值較高或更低，可能會不適用於定序反應，因為定序時的PCR反應之annealing溫度為50℃。

6.      3’端第一個 nucleotide 不為A，因3’端A於錯配(mismatch)發生時，polymerase仍有較大機率仍會進行extention。

7.     引子自身及引子之間若有連續4個鹼基互補，或含有限制酶切位，易造成self annealing。引子自身互補會形成Hairpin的二級結構，而引子間互補會形成primer dimer，皆不利於PCR與定序反應。

8.     引子的mismatch若集中在5’端，仍有能會與目標序列的其他位置黏合，需注意以免PCR或定序時會產生多種序列。

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