掌握引子設計的要點,能幫助您有效並精準地進行PCR實驗與定序分析,一般PCR與定序引子設計時可注意以下幾點:
1. 定序與PCR引子通常建議介於18-25 mers,GC%介於30-80%
2. 引子必須檢查是否與目標序列只有一個binding site,若有二個(含)以上,定序和PCR時會呈現多種序列。
3. 為確保引子專一性,於3’端至少要有10個nucleotide與目標序列完全互補,且3’端避免2 組以上 G+C(GCGC),因為可能黏合上序列中GC rich區域。另外,定序引子盡量避免為複合序列。
4. 避免連續的鹼基出現,連續鹼基在引子合成時容易產生合成不完全的現象,尤其連續 4 個以上的 G 出現,還會大幅提高引子的Tm值。
5. 定序使用的引子建議Tm值介於50-58 ℃,若您的PCR引子Tm值較高或更低,可能會不適用於定序反應,因為定序時的PCR反應之annealing溫度為50℃。
6. 3’端第一個 nucleotide 不為A,因3’端A於錯配(mismatch)發生時,polymerase仍有較大機率仍會進行extention。
7. 引子自身及引子之間若有連續4個鹼基互補,或含有限制酶切位,易造成self annealing。引子自身互補會形成Hairpin的二級結構,而引子間互補會形成primer dimer,皆不利於PCR與定序反應。
8. 引子的mismatch若集中在5’端,仍有能會與目標序列的其他位置黏合,需注意以免PCR或定序時會產生多種序列。
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