RNA 萃取時需注意,RNA 本質並不穩定,其為單股核酸,易遭水解或熱降解。此外,RNA降解酶 (RNase)比DNA降解酶 (DNase) 穩定且較難失去活性,外在環境須注意RNase 的汙染,除了操作人員必須戴上手套,萃取過程使用的器具及溶液也須經過 RNase 抑制劑預先處理,例如:diethylpyrocarbonate (DEPC)。細胞內也有 RNase 活性,因此收集到的樣本建議立刻進行 RNA 的製備工作。若須暫時儲存,應以液態氮將樣本急速冷凍後,儲存於 -80℃ 冷凍櫃。之後取出的樣本應立即以液態氮研磨的方式,加入 RNA 萃取緩衝液,以避免 RNase 作用。
目前最常見的RNA萃取方法為有機溶液萃取,通常使用 Trizol 進行萃取,其成分包含苯酚 (phenol) 和異硫氰酸胍 (guanidinium isothiocyanate) ,可以裂解細胞,同時抑制細胞釋放出的 RNase 作用。樣本和 Trizol 先混合,再加入氯仿 (Chloroform) 混合後離心,取出 RNA 所在之上方水層,通過異丙醇 (isopropanol) 及乙醇 (ethanol) 沉澱清洗,最後使用 RNase-free 緩衝液回溶。
管柱萃取與磁珠萃取也可以取得 RNA,操作方法與先前介紹的 DNA 萃取方法相似,透過調整 pH 值及鹽濃度,使 RNA 吸附於含二氧化矽 (silica) 的濾膜或磁珠,再進行後續沉澱與清洗,最終將 RNA 回溶於 RNase-free 緩衝液中。
萃取出的 RNA 建議不要多次解凍,可等量分裝儲存於 -80℃ 冷凍櫃,減少 RNA 降解影響後續實驗分析。
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