【Experimental Techniques Series- Interpretation of sequencing chromatograms (2)】
上週介紹了四種拿到定序結果後常遇到的問題，
今天來談談另外五種常見的定序情況：
1. Free dye影響造成的現象：
定序結果在70 bp或110 bp附近出現強烈的螢光染劑訊號，可能是引子黏合Template DNA效果不佳或是螢光染劑殘留，造成訊號與背景值(S/N值)差異過小，而產生的現象。藉由增加Template DNA或是引子重新設計來增加訊號強度；以及定序反應試劑濃度調整並重新純化上機產物後可以有所改善！
2. Primer n-1位移 (Shift)現象：
在定序數據主要的波峰訊號上，出現一個鹼基長度位移 (n-1)的小波峰次訊號。可能是引子降解或是合成引子的次級產物殘留在其中，使得長度缺少一個鹼基的引子在模板DNA上進行非專一黏合，而有定序結果n-1位移的情形，可以透過重新稀釋引子或是提高引子純化規格 (如：HPLC或PAGE)重新合成引子來改善。
3. Template DNA發生突變：
DNA進行PCR時可能發生突變；或是製備clone時，建構的質體DNA (plasmid construct)對細菌有毒性，因此誘發突變產生。當遇到這種情況時，可以改用具有校對 (proofreading)功能的DNA聚合酶來進行PCR反應；或是於cloning時更換不同菌株 (strain)的勝任細胞 (competent cell)。
4. 出現高聳的訊號波峰：
訊號呈現高於周圍螢光數值的高聳波峰，使得定序數據無法進行判讀，這種情況通常為毛細管內有氣泡或是雜質干擾，只要重新上機就能解決，源資在data QC時遇到此種情況也都會免費重新進行上機哦！
5. 螢光訊號微弱：
當定序數據的螢光值平均低於100，此時背景值較高會造成定序的訊號無法判斷。造成此結果的原因可能為DNA template量太少，或是primer專一性不佳。改善方法為增加DNA template的量，或是重新設計專一性較好的primer，通常即能大幅改善這種定序情況。
只要data QC確實有做好，troubleshooting精準到位做判斷，即使定序失敗也不用怕！
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