mRNA-Seq (messenger RNA sequencing) 是目前最常用來研究基因表現的高通量定序技術，可了解樣本中 mRNA 的種類、表達量與轉錄變化，並透過分析樣本在不同條件下的轉錄體數據，找出關鍵基因與受影響的訊號傳導途徑，是理解生物狀態與分子機制的重要工具。

       mRNA-seq基因轉錄體定序分析流程 :

1. Raw data QC : 高通量定序所獲得之原始數據先進行品質檢測 (GC分布，Phred score)，以確定其品質可往下進行後端分析，接著設定參數將定序品質較差的序列去除，保留高品質的數據，確保後端分析結果的可信度。

2. Gene expression level analysis : 將QC後的數據比對序列資料庫，計算FPKM值 (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment) 或RLE值(Relative log Expression)，計算樣本基因表現及變化量。

3. Correlation Analysis : 評估樣本之間整體基因表現相似度。利用所有基因的表現量，計算兩兩樣本之間的 Pearson 係數，並以相關矩陣 PCA (Principal Component Analysis) 及 NMDS (Non-metric multidimensional scaling) 圖呈現。此分析的意義在於確認相同處理樣本之間是否彼此相似，以及不同條件是否呈現預期的差異。如果同組樣本的相關性高，代表樣本間差異主要來自實驗處理；若同組樣本相關性低，可能表示樣本品質不一致、處理不穩定或有混入汙染樣本。相關性分析是 RNA-Seq 中檢查資料可靠度與確定樣本間生物差異的重要步驟，直接影響後續差異表現基因分析的可信度。

• Comparison Analysis : 通常包含差異表現基因分析 (DEG)與統計檢定。可找出不同條件、處理或族群之間基因表現量的差異。透過將兩組或多組樣本的基因表現量進行比較，能揭示哪些基因因疾病、藥物處理、突變、環境變化等因素而被上調或下調。這些被顯著改變的基因提供研究者關於生理反應、訊號路徑活化、代謝變化或細胞狀態轉換的線索，並可能進一步指向新的生物標記、致病機制或潛在治療標靶。因此，Comparison 分析是 RNA-Seq 中最關鍵的步驟之一，讓海量原始序列轉化成具有生物意義的科學發現。

• Heatmap analysis : 將基因表現量以顏色深淺表示，並搭配階層式聚類同時對基因與樣本分組，使相似表現趨勢的基因或樣本自動聚在一起，以視覺化的方式呈現基因在不同樣本之間的表現模式，特別適合觀察差異基因的群體行為。其生物學意義在於可快速看出上調與下調基因的整體分布、不同實驗組之間的群聚關係，以及是否存在共同調控的基因群。若相同處理組別樣本在熱圖中聚在一起，代表資料品質穩定；若不同處理組呈現清晰分群，則顯示處理效果明確。熱圖是理解基因調控模式、樣本關係與生物學現象的重要視覺化工具。

• Pathway enrichment Analysis : 使用KEGG Automatic Annotation Server (KAAS)進行KEGG Orthology (KO) ID的預測，並藉此對應出所在的生合成代謝途徑，再將個體間表現量差異的基因比對KEGG資料，以瞭解這些有顯著表現差異的基因是參與哪些生合成代謝途徑。

• GO enrichment Analysis : 使用GO-TermFinder，將個體間表現量差異的基因比對其物種的GO資料庫，再針對三個GO類別 (Cellular component, Molecular function, Biological process) 分別做enrichment。此分析能從大量基因變化中找出受到影響的生物功能層級，協助研究者理解生理機制、細胞反應與可能的調控網絡，是轉錄體分析中最常用也最重要的功能解讀方法之一。

        整體來說，mRNA-Seq 是當代生命科學研究中最具影響力的工具之一，從基礎到臨床應用都能發揮關鍵作用，因此已成為現代生物研究的必備技術。

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