即時定量PCR (Quantitative real-time PCR; qPCR)為最常用來作為偵測DNA/RNA表現量的實驗技術，其定量方法一般會使用SYBR或TaqMan探針 (probe)系統。其中引子及探針是決定實驗結果是否成功的關鍵，小編將帶領大家來了解一下引子及探針設計需要注意的一些眉角吧！

SYBR qPCR用的引子設計需要留意以下要點：

1.    引子長度一般為18~25bp；Tm值約為60度

2.    引子的GC含量佔40~60%；並且避開可能形成二級結構的區域

3.    引子自身及引子之間應盡量避免連續4個鹼基的互補

-自身的互補會形成髮夾 (hairpin)結構；引子間的互補會產生引子二聚體 (primer  dimer)，皆會使qPCR的效率降低

4.    避免出現連續3個以上的G或C出現；且引子的3’端盡量避免選擇鹼基A

-鹼基A容易發生錯誤配對 (mismatch)，因此降低PCR效能

5.    設計在跨外顯子-外顯子接合處 (exon-exon junction)或不同外顯子上

-可以排除殘留的DNA造成的偽陽性結果

TaqMan系統的引子及探針在設計上則需要注意以下細節：

1.    TaqMan系統的引子設計原則上與SYBR qPCR的引子都相同；PCR產物大小建議在50~150bp

2.    探針與上游引子的距離愈近愈好；且探針5’端的第一個鹼基不能為G

-鹼基G會激發螢光產生，產生偽陽性螢光訊號

3. 探針長度約為15~30bp；Tm值需高於引子的Tm值5~10度；GC含量佔30~80%

4. 探針中應避免連續3個以上的重複鹼基出現；且序列中C的鹼基數需多於G

       最後，當設計完成時，使用NCBI中的Primer-blast工具進行引子及探針的序列比對，確認其專一性後，就能往下繼續qPCR的實驗囉！

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