傳統的RNA Seq建構的文庫讀長大約為50-100 bp，因此在數據組裝的準確度及RNA轉錄異構體 (Transcript isoform)的定量上較有挑戰性，也難以精準地檢測出poly(A)的長度。此外，文庫製備過程中的反轉錄 (Reverse transcription)及增幅 (Amplification)步驟不會保留RNA的鹼基修飾，並且通常會造成PCR偏好性 (bias)。因此，Oxford Nanopore開發出了一種可以直接定序原始RNA分子的長讀長三代測序技術-- Direct RNA sequencing，能夠克服以上缺點，提供高產出及全長序列，可以對轉錄本 (Transcript)進行明確的定量，真實反應基因表現量。

Nanopore Direct RNA sequencing進行前要先確認RNA樣本的品質，高純度且完整未降解的RNA樣本才能得到準確的定序結果。可以使用Total RNA或經篩選過帶有poly(A)的RNA樣本；若為來自原核細胞或沒有poly(A)的RNA樣本則需要先外加poly(A)在RNA分子的3’端。上機樣本的製備首先在RNA的poly(A)末端接上帶有互補poly(T)的反轉錄adapter，接著進行反轉錄合成互補股的cDNA，最後在RNA-cDNA hybrid末端接上定序用的adapter，即可在Nanopore納米孔平台上機進行定序。cDNA啟到輔助結構穩定作用，並不會通過納米孔洞，只有RNA會進入納米孔中完成序列讀取。

Direct RNA sequencing能夠準確辨識RNA轉錄異構體(Transcript isoform)並加以定量，加上能夠直接得到鹼基修飾(m6A)的資訊，因此能夠應用在探討癌症或其他疾病的致病機轉上。由於能夠讀取全長轉錄本序列，所以可以明確識別出融合基因轉錄本(Fusion gene transcript)，在尋找疾病的大片段重複序列嵌入的變異或融合基因上有很大的助益。另外，Direct RNA sequencing能夠應用於鑑定RNA病毒及病毒流行病學上，即時的RNA長讀長測序技術可以快速提供分析結果，因此在臨床檢測上也具有許多潛在的優勢！

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