磁珠是高通量測序(NGS)製備過程重要工具之一,磁珠顆粒在特定的條件下,磁珠可與核酸、標的片段進行結合及解離。各式各樣的磁珠,各自的表面性質不同,分離的方法也不盡相同,但其材料的組成、基本的結構,及作用原理並無太大的差異。磁珠基礎結構一般分為3層,最內層的核心是聚苯乙烯,第二層為包覆磁性物質-四氧化三鐵(Fe3O4),最外層表面則是修飾的高分子材料所構成(比如說:羧基(-COOH)表層行使與核酸結合的工作;(dT)序列修飾表層行使與去氧核酸mRNA結合的工作)。
以下針對DNA與磁珠純化、片段篩選的作用原理列點說明:
- 磁珠的作用原理是基於固相載體可逆化固定(Solid Phase Reversible Immobilization, SPRI)的分離純化方法。磁珠體系中通常包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及鹽離子等,在一定濃度的PEG和鹽離子環境中,DNA可吸附在羧基修飾的高分子磁珠表面,該過程是可逆的,在適當條件下,結合的DNA分子可以被elute回收。
- 當處於PEG和鹽離子環境中的DNA,因脫水作用而發生分子構象改變後,會暴露出磷酸骨架上大量的帶負電荷的磷酸基團,與表面帶負電荷的羧基磁珠結合。帶負電的磷酸基藉由解離的鹽離子(如Na+)與羧基形成離子橋,使DNA被特異性吸附在羧基磁珠表面。當PEG和鹽類被去除之後,加入水性分子,解除其三者之間的離子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。
- 在磁珠體系中,PEG是影響DNA回收條件重要的因素之一(其他因素還包括DNA大小和濃度、鹽離子濃度、孵育時間等等)。DNA在一定PEG濃度存在的條件下,NaCl或MgCl2促進使DNA發生脫水反應,此時DNA分子結構會發生變化,由線狀被壓縮形成捲曲球狀,繼而聚集沉澱。隨著PEG量、濃度以及鹽濃度的不同,不同長度的DNA可以被選擇性的沉澱出來。
- NGS文庫製備流程中,由於二代測序段短讀長的局限性,因此,評估產物挑選合適的磁珠與樣本比例,保留或排除所需片段大小,以滿足上機長度的需求。磁珠分選第一輪磁珠結合分子量較大的DNA,丟棄磁珠去除這部分產物;第二輪磁珠結合剩餘產物中分子量較大的DNA,丟棄上清去除分子量較小的DNA。分選目標位置不同時,雙輪磁珠使用量也不同。
磁珠的出現,使得核酸製備的實驗相較於傳統的回收方式,更具有以下幾項明顯的優勢,比如說:
- 樣本核酸的回收效率比傳統方式更好。
- 實驗操作起來簡單,實驗無須離心,更可保留核酸的完整性
- 實驗操作避開了有機溶劑的使用(如酚類、氯仿等等),操作上更加安全等
- 磁珠片段篩選使得實驗可以進行核酸大小的選擇,有效純化出特定需求的片段DNA。
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